CSI als Kontext im Chemieunterricht

Worum geht es überhaupt? Der molekulare Kontext des genetischen Fingerabdrucks.

  • DNA aus der Zelle/ Zellkern isolieren
  • individuelle DNA-Bereiche via PCR vervielfältigen
  • amplifizierte (vervielfältigte) DNA-Bereiche verschiedener Personen vergleichen

Einführung in die Polymer-Chemie:

  • Polymere = langkettige Moleküle aus immer wiederkehrenden Baueinheiten (Monomeren)
  • Bekannte Polymere nennen, skizzieren, Gemeinsamkeiten und Unterschiede (Monomere, Bindungen, Entstehung/ Bildung) aufzeigen.
  • Besonders wichtig sind im CSI-Kontext die Polymere DNA, Proteine sowie Polysaccharide.
  • Lipide und Phospholipide sind zwar keine Polymere, spielen aber im CSI-Kontext auch eine wichtige Rolle.

Wichtig für das Verständnis der ersten Arbeitsphase der DNA-Isolation sind Bau und Funktion der Lipide bzw. Phospholipide.

  • Um den Aufbau, die Anordnung in der Zelle und ihre Rolle als Barriere-Bausteine zu verstehen, muss man kennen: Zwischenmolekulare Wechselwirkungen (Van-der-Waals-Wechselwirkungen, Dipol-Dipol-Wechselwirkungen, Ion-Ion-Wechselwirkungen, Ion-Dipol-Wechselwirkungen), Esterbindungen.
  • Es sollte thematisiert werden, wie Zellen grob aufgebaut sind und wo sich hier Biomembrane befinden sowie was deren Rollen sind.
  • Die Biomembrane werden bei CSI mit dem Tensid-ähnlichem SDS zerstört, um überhaupt an die DNA zu gelangen.

  • Die Orientierung der Phospholipide im wässrigen Medium (wie z.B. in Blut, zwischenzelluläre Flüssigkeit, Zellplasma, Kernplasma,…) sowie die gegenseitige seitliche Aneinanderlagerung leiten sich aus ihrem Aufbau ab.
  • Die Relevanz von ungesättigten Fettsäuren und eingelagertem Cholsterin sollte hier thematisiert werden.

DNA

Bei CSI geht es hauptsächlich um die DNA, ihre Synthese und die Untersuchungen von DNA-Fragment-Längen. Daher muss thematisiert werden:

  • Aufbau der Monomere
  • Aufbau der DNA als ein spezielles Polymer, nämlich eine Doppelhelix aus zwei Polymeren.
  • Schön lassen sich hier Veresterung, Dipol-Dipol-Wechselwirkungen (wer mag auch Stapelwechselwirkungen/ Van-der-Waals-Wechselwirkungen übereinander liegender Basen) thematisieren.
  • Das Aufschmelzen der DNA muss in Bezug zur PCR thematisiert werden. Auch die Schmelztemperatur in Abhängigkeit vom GC-Gehalt bietet diesbezüglich einen netten Kontext.
  • Historische Exkurse zur Entdeckung/ Entschlüsselung der DNA durch Watson & Crick sowie Rosalind Franklin sind spannend. Beispielsweise kann man die Röntgenbeugung/ Kristallographie erläutern oder auf das Problem der Keto-Enol-Tautomerien der Basen ansprechen.
  • Die Zuckerchemie (offenkettige Fischer-Projektion und ringförmige Haworth-Projektion) oder Keto-Enol-Tautomerien sollten hier vertieft werden, wenn man die zentrale Zuckereinheit der Nukleotide bespricht (Ribose bei RNA, Desoxyribose bei DNA).
  • In jedem Nukleotid finden sich Esterbindungen (aus Hydroxygruppe und Phosphat).
  • Sind Adenin, Guanin, Thymin und Cytosin wirklich Basen?
  • Säure-Base-Chemie der Phosphorsäure (und Deprotonierungsstufen wie Hydrogenphosphate, Phosphat)

Die zentrale Zuckereinheit der DNA-Nukleotide, die Desoxyribose, liegt in Haworth-Projektion vor. Hier lassen sich die Gleichgewichtsreaktionen der Mutarotation oder ganz allgemein die Grundlagen der Zuckerchemie wiederholen. Wie kam man nochmal von der Fischer-Projektion zur Haworth-Projektion? Was waren Anomere (alpha- und beta-Form)?

Der dreidimensionale Aufbau der zentralen Zuckereinheit ist entscheidend für die räumliche Struktur der Nukleinsäuren. Insofern muss man sich mit der räumlichen Struktur der Ribose/ Desoxyribose beschäftigen (Fischer- und Haworth-Projektionen von Kohlenhydraten s.u.).

Rund um die PCR-Methode

  • Das „Aufschmelzen der DNA“ bei der Denaturierungsphase lässt sich auf etwas philosophische Weise diskutieren: Welchem Prozess entspricht das „Aufschmelzen der DNA“ am meisten: „Schmelzen“, „sieden“ oder „sublimieren“?
  • Zu welchem Ergebnis man auch für sich kommen mag: Durch Temperaturerhöhung wird die Teilchenbewegung erhöht; irgendwann ist die Tielchenbewegung so hoch, dass die Dipol-Dipol-Wechselwirkungen zwischen den Nukleotiden der komplementären, antiparallelen DNA-Einzelstränge nicht mehr ausreichend stark sind, um die beiden linearen DNA-Einzelstrang-Polyester aneinander haften zu lassen; welche daraufhin auseinander gehen.
  • Die Wahrscheinlichkeit, dass sich nun Primer und Nukleotide anlagern, ist höher, als dass sich die frisch getrennten DNA-Einzelstränge wieder aneinander lagern. Damit eine Aneinanderlagerung aufgrund von Dipol-Dipol-Wechselwirkungen überhaupt möglich ist, muss wieder abgekühlt werden.
  • Auch das Enzym DNA-Polymerase muss sich wieder gemäß dem Schlüssel-Schloss-Prinzip an die DNA-Stränge lagern können.
  • Die Polymerase katalysiert die Veresterung der Hydroxygruppe der Desoxyribose mit deprotonierter Phosphorsäure (Phosphat).

  • Die DNA liegt jedenfalls in wässriger Lösung (wie z.B. im Zellplasma) als Poly-Anionen vor. Der Name „Zucker-Phosphat-Rückgrat“ sagt es ja bereits: Es liegen viele Phosphatgruppen vor, wobei jede Phosphatgruppe negativ geladen ist. Denn eine Phosphatgruppe ist ein deprotoniertes Phosphorsäure-Anion (auch wenn hier verestert) .
  • Die Phosphorsäure ist eine dreiwertige Säure, die ihre teilpositiv geladenen H-Atome als Protonen nacheinander heterolytisch abspalten kann. Die Protonen werden von Wassermolekülen, welche in diesen Fällen als Base reagieren, durch ein freies Elektronenpaar des teilnegativ geladenen O-Atoms gebunden.
  • Alle Säure-Base-Reaktionen mit Wasser sind Gleichgewichtsreaktionen, weshalb zu diesen Reaktionen das MWG sowie Ks-Werte hergeleitet werden können. Die zu den drei Protonierungsstufen gehörigen pKs-Werte sind :         pKs1 = 2,161;        pKs2 = 7,207;       pKs3 = 12,325
  • H3PO4(aq) + H2O(l) H3O+(aq) + H2PO4(aq)    Ks1=6,9103
  • H2PO4(aq)+H2O(l) H3O+(aq)+HPO24(aq)     Ks2=6,2108
  • HPO24(aq)+H2O(l) H3O+(aq)+PO34(aq)        Ks3=4,71013

(Quelle: https://www.chemie-schule.de/KnowHow/Phosphors%C3%A4ure)

Zur PCR benötigt man DNA als Vorlage, Nukleotide als DNA-Bausteine, Primer (als geschickt gewählte unfertige DNA-Einzelstrang-Kopien, welche die zu amplifizierenden Bereiche einrahmen), hitzestabile DNA-Polymerase.

Die Primer binden an hochspezifische, gut ausgewählte komplementäre DNA-Bereiche und werden selbst in 3´-Richtung verlängert. Wenn ein Primer z.B. 20 Nukleotide lang ist, dann ergeben sich bereits 4hoch20 DNA-Code-Möglichkeiten. Bei der PCR entsteht ein Gemisch unterschiedlich langer DNA-Fragmente, die dann mithilfe der Gelelektrophorese als Trennmethode voneinander getrennt werden können.

Gelelektrophorese

Größere DNA-Fragmente bleiben häufiger im „Hindernisparcour“ des verzweigten Agarose-Polymers hängen und haben im Spannungsfeld (in Richtung Pluspol) eine geringere Wanderungsgeschwindigkeit.

Zwar könnte man sagen, dass mit jedem weiteren Nukleotid eine weitere negative Ladung (Zucker-Phosphat-Rückgrat) hinzukommt und die DNA dann stärker zum Pluspol angezogen wird, allerdings erhöht sich auch die bremsende Reibung im Gel. (Ein sehr netter Kontext für den Physikunterricht!)

Neben der Polymer-Chemie von Polysacchariden (Agarose = Polysaccharid) können hier auch weitere ähnliche Trennverfahren unterrichtet werden, wie z.B. GC oder DC.

Die negative Ladung des  Säurerestanions ermöglicht auch erst überhaupt die Bewegung der DNA im Spannungsfeld der Gelelektrophoreseapparatur.

Ein Gel, ein Ergebnis zweier Arbeitsgruppen im Chemikurs.

Warum die Banden leuchten? Siehe weiter unten bei Fluoreszenz…

Die von uns verwendete DNA-Leiter zeigt, dass die bei CSI amplifizierten DNA-Bereiche eine Länge von ca. 500-1500 bp haben.

 

 

 

 

 

 

 

Protein-Chemie

Proteine sind auch Polymere mit besonderen Funktionen.

Das Schlüssel-Schloss-Prinzip ist hier wichtig; schließlich findet die blinde, taube, nicht-interelligente Polymerase ihr Substrat nur gemäß diesem Prinzip. Das Enzym Polymerase erkennt nach dem Schlüssel-Schloss-Prinzip (Form, Größe, Ladungen) folgende Molekül-Kombination:

  • DNA-Einzelstrang als Vorlage
  • unfertige DNA-Einzelstrang-Kopie mit 3´-Ende

Der räumliche Bau von Aminosäuren und damit von Polypeptiden ist entscheidend. Und zu klären ist, welche Anziehungskräfte die Substrate (DNA-Einzelstrang-Vorlage, unfertige DNA-Einzelstrang-Kopie und Nukleotide) in das aktive Zentrum ziehen. Bei der räumlichen Koordinierung spielen sogar eingelagerte Magnesium-Kationen eine Rolle.

Sind einmal nach dem Schlüssel-Schloss-Prinzip das Enzym Polymerase und die DNA-Stränge aneinander gelagert, so verlängert die Polymerase dann die unfertige DNA-Einzelstrang-Kopie, indem es in 3´-Richtung die unfertige DNA-Kopie verlängert. Dazu werden entsprechend komplementäre Nukleotide an die DNA-Einzelstrang-Vorlage angelagert und eine am 5´-Ende gebundene Phosphatgruppe an eine am 3´-Ende gebundene Hydroxygruppe enzymatisch katalysiert verestert.

Wichtig ist hier, dass die (Taq)-DNA-Polymerase mit ihrem aktiven Zentrum folgende Struktur erkennt: DNA-Einzelstrang-Vorlage und unfertige komplementäre DNA-Einzelstrang-Kopie. Am unfertigen 3´-Ende der Kopie setzt die Polymerase mit ihrem aktiven Zentrum an und verlängert dieses in 3´-Richtung, indem komplementäre Nukleotide an die Einzelstrang-Vorlage via Wasserstoffbrückenbindungen angelagert werden und das Zucker-Phosphat-Rückgrat durch enzymatisch katalysierte Veresterungen (der Hydroxygruppen am 3´-Ende der Zuckereinheit mit der anorganischen, deprotonierten Phosphorsäure am 5´-Ende der Zuckereinheit) in 3´-Richtung verlängert wird.


Fragen, wie z.B. hitzestabile Proteine gebaut sind, lassen sich klären. Bis hin zu den Reaktionsmechanismen mit koordinierenden Kationen in dem aktiven Zentrum der Polymerase eignet sich das Thema für einen tiefen Einblick in die Molekularbiologie.

Der dreidimensionale Aufbau der Polymerase ist begründet im dreidimensionalen Aufbau ihrer Monomere, den Aminosäuren.  Die einzelnen dreidimensionalen Bausteine werden via Peptidbindung in Form einer Kondensationsreaktion miteinander verknüpft. So entstehen immer längere, dreidimensionale Peptide (Di-, Tri-, …., Oligo-, …., Polypeptid).

Einzelne Bereiche ungefalteter Polypeptide (Polypeptide in Primärstruktur) können sich zu Sekundärstrukturen wie alpha-Helix und beta-Faltblatt falten. Wasserstoffbrückenbindungen halten diese Sekundärstrukturen aufrecht.

Die einzelnen Bereiche der Polypeptide können sich stellenweisen untereinander auch wieder via Wasserstoffbrückenbindungen , Ion-Ion-Wechselwirkungen und Van-der-Waals-Wechselwirkungen anziehen.

So können schließlich hoch-komplex gefaltete, durch Wechselwirkungen stabilisierte Polypeptide aus Kombinationen aus Primär- und Sekundärstrukturen, die sogenannten Tertiärstrukturen, entstehen. Ferner können noch Disulfidbrücken die Faltungen stabilisieren. 

Räumlich gebaute Aminosäuren lassen sich via Fischer-Projektion eindeutig dargstellen.

Zucker-Chemie

Je nach Anzahl der C-Atome kann man z.B. Pentosen (Bsp. Ribose) von Hexosen (Bsp. Glukose oder Fruktose) unterscheiden.

Je nach dem , ob eine Aldehyd- oder Keto-Gruppe im Kohlenhydratmolekül vorhanden ist, spricht man von Aldose oder Ketose. Über die Keto-Enol-Tautomerie lassen sich Keto- und Adlehyd-Form ineinander umwandeln (Gleichgewichtsreaktion).

Über das Phänomen der Mutarotation lassen sich offenkettige und ringförmige Strukturen ineinander umwandeln (Gleichgewichtsreaktion). Die alpha- und beta-Form sind Isomere, man nennt sie Anomere.

Die Fischer-Projektion lässt sich auch auf die Kohlenhydrate anwenden.

Aufgaben für das Arbeiten mit dem Modell.

 

Vergleich der Fischer-Projektionen für Aminosäuren und Kohlenhydrate.

Vom Monosaccharid in Fischer-Projektion zum Monosaccharid in Haworth-Projektion

 

Im Atommodell nachgebaute Ribosen.

Vom Monosaccharid zum Disaccharid (z.B. Saccharose) und zum Polysaccharid (z.B. Agarose)

 

 

Und weshalb leuchten nun die DNA-Fragmente im Gel?

In der näheren Auswahl gibt es drei Möglichkeiten für Leuchterscheinungen:

1. Chemolumineszenz: Exotherme chemische Reaktion, bei der u.a. Energie in Form von elektromagnetischer Strahlung abgegeben wird, die dem sichtbaren Spektrum elektromagnetischer Wellen entspricht, die fotochemische Reaktionen in unserem Auge auslösen (Fotoisomerisierung des 11-cis-Retinals), woraufhin unsere Fotorezeptoren (Sehsinneszellen) entsprechende Informationen in das Nervensystem einspeisen (Gehirn: Wir sehen Licht). Bei der Biolumineszenz geschieht das Gleiche, nur in tierischen Zellen.

Anleitung für ein Demoexperiment zur Chemolumineszenz siehe folgende Tafelbilder. Außerdem hier ein Video zur Chemolumineszenz.

2. Fluoreszenz: Einstrahlung energiereicher elektromagnetischer Wellen, meist zu energiereich für die Wahrnehmung unserer Augen. Die Fluoreszenzfarbstoffe absorbieren einen Teil der Energie (wandeln ihn in Wärme um etc.) und reemittieren energieärmere elektromagnetische Wellen, welche aber wiederum genau den Energien entsprechen, die fotochemische Reaktionen in unseren Augen auslösen und wir somit das Licht wahrnehmen.

3. Phosphoreszenz: Licht in Stoffen einstrahlen, so etwas wie eine verzögerte Fluoreszenz. (Kennt man von Ziffernblättern von Uhren.)

Bei unseren Gelen handelt es sich um eine Fluoreszenz.

Unsere Apparatur strahlt energiereiches bläuliches Licht ein, die Farbstoffe reemittieren energieärmeres grün-gelbes Licht.

Absorptions- und Emissionsspektrum von SYBR Green I gebunden an dsDNA.

Bildquelle: https://de.wikipedia.org/wiki/Datei:SYBR_Green_I_Spektrum.png (26.4.2018; 17.30Uhr)  Urheber Klaus Hoffmeier Daten von Molecular Probes, Graphik selbst erstellt mit Excel